A clonagem molecular envolve a replicação e recombinação de moléculas de DNA. Os primeiros experimentos de clonagem foram realizados na década de 1970, quando foram descobertas as endonucleases de restrição. As endonucleases de restrição são enzimasque clivam e cortam seletivamente o DNA como uma tesoura.
Estas enzimas permitiram aos cientistas cortar um pedaço específico de ADN, geralmente um gene, e colocá-lo num vector onde pode ser copiado. Também podem ser feitas alterações no segmento de DNA clonado no processo. A clonagem tornou-se um método fundamental aplicado na biologia molecular e está subjacente a grande parte da genética.
O processo básico de clonagem consiste em o isolamento de uma sequência de DNA e inseri-lo em um veículo denominado vetor para propagação em uma espécie hospedeira, que geralmente é uma bactéria ou levedura. Esses clones podem então ser usados para análise genética, produção de proteínas, criação de mutações e muitos outros propósitos.
Isolamento de DNA
Um experimento de clonagem começa identificando um segmento de DNA que foi pré-marcado. Freqüentemente, este é um gene inteiro. O método mais comum de copiar o gene é por reação em cadeia da polimerase (PCR). PCR amplificar (amplifica) apenas o trecho desejado de DNA.
Após a amplificação do DNA, as extremidades são preparadas para ligação com enzimas de restrição. As enzimas de restrição são selecionadas de acordo com suas compatibilidade com o vetor desejado. O segmento genético amplificado é então incubado com enzimas de restrição para cortar as extremidades. Ao mesmo tempo, um vetor é preparado para aceitar o DNA. O vetor geralmente contém outros genes úteis para clonagem que podem ser usados para seleção.
Ligadura
Durante a ligação, o gene amplificado a ser clonado é incubado com o vetor. As extremidades de cada um são preparadas com enzimas de restrição para ter partes complementares de DNA de fita simples.
Transformação
Uma vez preparado o vetor de DNA, ele deve ser multiplicado em bactérias. O processo de induzir a bactéria a absorver o vetor de DNA é chamado de transformação. As bactérias são geralmente preparadas para transformação por tratamento com cloreto de cálcio.
As bactérias transformadas são cultivadas em cultura. É necessário um método para selecionar apenas as bactérias que absorveram e expressaram o DNA do vetor. O método mais comum é usar um gene de resistência a antibióticos incluído no vetor. O meio de crescimento da bactéria contém o antibiótico, portanto as culturas resultantes devem conter apenas bactérias transformadas com sucesso.
O primeiro experimento de clonagem molecular foi realizado em 1973. Agora o método se tornou comum e numerosos inovaçõespara tornar a clonagem molecular mais rápida, fácil, confiável ou personalizada para tipos específicos de genes e aplicações.
Referências:
1. Ciência Direta. Clonagem molecular
2. Shaffer, Catherine. “Clonagem molecular”. Notícias-Médicas
3. Centro Nacional de Informação sobre Biotecnologia (NCBI). Biologia molecular da célula. 4ª edição. Isolando, clonando e sequenciando DNA
